NHS（N-Hydroxysuccinimide）をご利用いただく際のチェックポイントについて

バイオ研究の分野ではカルボン酸とアミンの反応にはNHS(H-Hydroxysuccinimide：活性エステル)を使用することが唯一の選択肢とされていて、前駆体のカルボン酸に脱水剤を混ぜてアミンと反応させるという発想が全く無いように見受けられます。

一方、有機化学の研究者にとってNHSは何も特別なものではなく選択肢の一つに過ぎません。NHS化物が安価に市販で入手できれば迷わずそれを使いますが、そうでなければカルボン酸をわざわざNHSに導いて精製するような面倒はせず、下記Fig.4のようにカルボン酸+脱水剤の組み合わせでワンポット反応してしまいます。

NHSの利点

• NHSをアミン成分と混ぜるだけで目的のアミド結合が出来ます。特に難しい技術は不要です。
  
• 反応系内に別のカルボン酸があっても副反応の心配がありません。
  

NHSの欠点

• 前駆体のカルボン酸から誘導するため一般にはカルボン酸よりも高価です。
• NHS化物が貧溶媒を用いた沈殿操作で脱水剤等と分離できる場合はよいのですが、そうでない場合は加水分解しやすい構造のため精製が困難です。カラム精製中の一部加水分解は避けられず、大抵は未精製で次のアミド化に使用することになります。
• 微量の水と反応して加水分解するため保存安定性に不安があります。特に一度開封すると空気中の水分により徐々に分解してしまいます。
  実際、市販のNHS化合物を大過剰のアミン化合物を反応させてLC-MS分析すると、NHSが加水分解されたカルボン酸が少量認められることが多いです。

NHSを使用した方が楽なケース

• 複数のカルボン酸が反応系内に存在する場合で脱水剤を多めに使ってしまったら、望ましくない方のカルボン酸が過剰の脱水剤で活性化されアミンと反応してしまう副反応が起こり得ます。これで生じた副生物にもアミンとカルボン酸があるため更に過剰の脱水剤と反応して複雑なオリゴマー混合物を形成してしまう可能性があります。
  

NHSを使わなくてもカルボン酸+脱水剤で事足りる事例

• 上記以外のすべて。脱水剤を混ぜるだけでOKです。投入する順番も気にする必要はありません。
• 上記の場合でも、ワンポットの2ステップ反応にすることと、カルボン酸に対して厳密に1:1（またはカルボン酸よりも若干少なめ）の脱水剤（図ではTSTUだが一般的な脱水剤：WSCでもBOPでも何でもよい）を用い、step2：アミン成分SM2'を加える前にサンプリングしてNHSの反応性チェックを実施するだけで副反応を回避できます。
  

特殊ケース

• 滅多にありませんがカルボン酸成分の同一分子内に別のカルボキシル基が含まれていて（SM1')、且つアミド結合位置の選択性を求められる場合、
  
• 目的のカルボキシル基だけが選択的にNHS化されたIM1'-2のような構造の市販品があれば、これを購入する以外の選択肢はありません。
• 市販品が見つからない場合は一つの手段としてFig5に示すような手順で得られた反応液からSideProduct1と2をHPLCで強引に分離する手法があります。しかし結合位置の異なる異性体同士の分離条件が見つからなければ混合物のまま使用せざるを得ませんし、仮に分離できたとしても目的のカルボン酸が活性化されていることを確認するための構造解析が容易でない場合があります。
• 選択性100%を狙うのであれば合成の手間が格段に掛かってしまいますが、Fig6の方法を採ります。普通はIM1’P-2をアミン成分と結合させてからTarget PrecursorのPGを脱保護しますが、そのPrecursorまたはTarget Compoundが脱保護条件で分解するようであれば別の保護基を検討するか、または先に脱保護してIM1'-2の構造を一度カラムで単離してからアミン成分と反応させます。後者では単離の過程で起こる一部加水分解がどうしても不可避です。
  

カルボン酸ではなくNHS（N-Succinimidyl活性エステル）での納品をご希望頂いた際、弊社では以下のように対応致します。

1. カルボン酸と等モルの脱水剤を用いてNHSに導きます。
   沈殿で精製できそうであれば反応液を貧溶媒に落としてから遠心または濾別して乾燥、一部を用いてアミンとの反応性を確認した上で納品いたします。
2. 目的のNHSが結晶性に乏しく沈殿しない場合、お客様のご要望に対応する形でカラム精製（シリカゲルまたはODS)を試みます。精製フラクションの乾燥品一部を用いてアミンとの反応性を確認した上で納品いたします。精製後の一部加水分解は避けられませんのでご理解頂きますよう、お願いいたします。
3. お客様からカラム精製のご要望がない、またはカラム精製中の激しい加水分解が避けられないことが判明した場合、カラム精製を省略します。反応液の一部を用いてアミンとの反応性を確認した上で減圧で溶媒を除去乾燥品を納品いたします。脱水剤の残骸（アミンとの反応には影響しません）が含まれますのでご了承ください。
4. 反応系内に他のカルボン酸が無いことが明らかな場合は、未精製で納品の場合でも原料のカルボン酸に対して少し過剰目の脱水剤を使用いたします。（この方がアミン成分との反応で100%に近い反応率になります）
5. 同一分子内に複数のカルボン酸があり、選択性が求められる場合はFig6に示すIM1'-2の構造で納品することになりますが、SM1'の合成でかなり面倒な工程が必要になると予想されますので個別ご相談させてください。
6. アミド結合形成反応までを弊社にお任せいただけるようでしたら別のアイデアもございます。是非ご相談させてください。

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